2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、壓力性尿失禁(Stress urinary incontinence,SUI)是指在咳嗽、噴嚏、大笑等腹壓增高時出現的不自主地尿液滲漏。SUI是女性最為常見的尿失禁類型,尤其是老年婦女。SUI癥狀經常發生在日?;顒又?,因此嚴重影響患者的生活質量和社交活動,亦帶來心理精神負擔。SUI發病機制尚不明確,但尿道固有括約肌功能不全(Intrinsic sphincter deficiency,ISD)是導致SUI的重要因素。ISD主要由于尿道括

2、約肌的平滑肌層或橫紋肌層或其支配神經出現損傷引起。具有ISD的SUI患者通常有更嚴重的尿失禁癥狀,且對常規的治療反應不佳。當保守治療失敗后,必須進行手術治療。目前首選的手術治療方式,如中段尿道懸吊術等,僅是增加對尿道的支持、固定作用,并不涉及對損傷或老化的尿道括約肌進行組織重建。而這類手術的長期成功率約為40-50%,有很大一部分患者會出現術后復發的情況。手術的局限性及逐漸進展的尿道括約肌平滑肌層老化衰退被認為是導致術后復發的原因。因此

3、,有效恢復受損的尿道括約肌是需要積極探索的重要治療方式。
  干細胞因其具備自我更新和多向分化的潛能,可應用于SUI患者的尿道括約肌再生,這引起了研究領域的極大興趣。目前,已有成體干細胞(肌肉來源、泌尿系來源、脂肪來源、骨髓來源等)在SUI動物研究或臨床研究中表現出在排尿功能的恢復、組織學的改善方面有較好的效果。但是,這些成體干細胞的臨床應用仍存在眾多問題,如提取的自體干細胞數量有限、細胞擴增準備時間過長、移植細胞為多種細胞類型混

4、合、攜帶表觀遺傳改變等等。這些障礙不利于干細胞療效的優化,也影響了我們對干細胞具體作用機制進行深入研究。因此,為避免上述問題,人胚胎干細胞或誘導多能干細胞或許可以成為新的干細胞來源。另外,現階段的干細胞實驗主要修復的是尿道外括約?。M紋?。?,尚未有僅針對尿道內括約?。ㄆ交。┰偕难芯繄蟮?。研究人員發現,在SUI研究中應用最廣的成體間充質干細胞在體內僅有一小部分能夠分化為平滑肌細胞,而由于成體間充質干細胞移植混雜有多種細胞類型,分化而來

5、的平滑肌細胞是否對尿道括約肌功能重建有促進作用及有關機制都無法明確。
  目的:我們試圖探索人胚胎干細胞和人誘導多能干細胞(Induced pluripotent stemcells,iPSCs)分化而來的單一平滑肌前體細胞(Progenitor smooth muscle cells,pSMCs)對重建SUI動物模型尿道功能的作用及機制。首先,通過在不同時間點對不同SUI大鼠建模方式的建模效果進行比較,以期找到更穩定更適宜干細胞

6、移植研究的長期SUI模型。在此基礎上,分化而來的pSMCs在移植入SUI大鼠尿道周圍一段時間后,根據LPP和尿道外周括約肌肌電圖(Electromyography,EMG)基線的測試,判斷尿道功能的恢復情況。根據尿道括約肌組織學檢查、細胞外基質(Extracellular matrix,ECM)主要組成彈性纖維和膠原纖維的蛋白比較、移植細胞體內融合實驗等分析平滑肌前體細胞恢復尿道功能的作用機制。
  方法:1、根據終末觀察時間的不

7、同將150只產后SD大鼠隨機分為三個獨立實驗:1周短期觀察實驗、4周和8周長期觀察實驗。每個實驗中,大鼠隨機分為對照組、尿道松解組、恥骨-尿道韌帶損傷(Pubo-urethral ligament injury,PULI)組和多次陰道球囊擴張組(Multiple vaginal distention,MVD)。除對照組及1周短期實驗中的尿道松解組和PULI組外,其余組均在手術的同時附加了雙側輸卵管卵巢切除術(Bilateral salp

8、ingo-oophorectomy,BSO)。1周短期觀察實驗通過Crede法對三個時間點進行漏尿點壓力(Leak point pressure,LPP)測試:術前、術后立即和術后一周。4周和8周長期觀察實驗通過Crede法和垂直-傾斜板(vertical tilt tabel,VT)法在術后4周和8周的終末時間點對LPP進行測試。術后8周LPP測試后收集大鼠的尿道進行組織學分析。2、108只成年未經產的Rowett裸鼠隨機分為四組:對

9、照組(無干預)、生理鹽水組(手術+生理鹽水注射)、膀胱平滑肌細胞(Bladder smoothmuscle cells,BSMC)組(手術+人BSMC注射)、平滑肌前體細胞(pSMCs)處理組(手術+pSMCs注射,包括人胚胎干細胞H9、游離型載體介導重編程的iPSC(Episomal reprogrammed induced pluripotent stem cells,Epi-iPSC)、逆轉錄病毒介導重編程的iPSC分化而來的pS

10、MCs)。根據第一部分實驗得出的更好的SUI建模方式對Rowett nude(RNU)大鼠進行手術。手術后3周,在尿道周圍注射分化好的平滑肌前體細胞(2×106個細胞/只)。注射5周后測試LPP和尿道外周括約肌EMG基線。3、對H9-pSMCs實驗中的四組(正常對照組、生理鹽水組、BSMC組、H9-pSMCs組)的尿道組織,進行平滑肌特異性蛋白、骨骼肌肌動蛋白雙重免疫熒光染色,評價尿道括約肌肌層的變化;進行彈性纖維、膠原蛋白雙重染色,評

11、價尿道ECM結構的變化;RT-qPCR檢測大鼠尿道組織中的人彈性蛋白、人ERV-3,判斷H9-pSMC是否在大鼠體內大量增殖及分化;Western Blot比較四組大鼠尿道組織中的彈性蛋白、膠原蛋白Ⅲ含量,對組織學結果進行驗證;在5只SCID小鼠單側后肢長收肌注射熒光素標記的1×106H9-pSMCs,進行體內生物信號BLI追蹤,并對注射部位的組織進行切片染色檢測pSMCs移植后的融合情況。
  結果:1、在1周觀察實驗中,尿道松

12、解組術后立即(33.69±2.27 cmH2O)和術后1周時的LPP(39.34±2.08 cmH2O)與術前(50.40±1.99 cmH2O)(p<0.05)相比顯著降低。MVD+BSO組的術后一周LPP(35.17±1.76 cmH2O)與術前(49.39±4.44 cmH2O)(p<0.05)相比也有同樣的結果;在4周觀察實驗中,各組與對照組相比均沒有顯著差異;而在術后8周時,僅有尿道松解組經VT法測得的的LPP與對照組相比顯著

13、降低(28.26±1.11 vs38.89±3.91 cmH2O)(P<0.05),其余組LPP均無差異。組織學結果也證實術后8周時,尿道松解組尿道中的彈力纖維和膠原纖維破壞得最為嚴重。2、iPSC分化而來的平滑肌前體細胞處理組,不論是游離型載體方法重編程的iPSC(N=9,mean=19.4±1.33 cm H2O),還是逆轉錄病毒方法重編程的iPSC(N=8,mean=18.45±1.41 cm H2O),與生理鹽水組(N=14,m

14、ean=14.16±1.07 cm H2O)(p<0.05)相比,LPP顯著升高,與尿道功能恢復相一致。而H9分化的平滑肌細胞處理組的LPP(N=22,mean=16.66±0.74 cm H2O)與生理鹽水組(N=10,mean=15.52±1.09 cm H2O)的差異并不顯著,但仍然顯示出了其LPP向正常對照組的LPP水平(N=13,mean=18.75±0.96cm H2O)靠攏的發展趨勢。3、尿道組織學顯示H9-pSMCs處理

15、的大鼠尿道與生理鹽水組相比具有更豐富的彈性纖維和更厚的肌層。Western blot結果證實H9-pSMCs處理組的大鼠尿道和膀胱中的彈性蛋白、膠原蛋白含量顯著增加。人彈性蛋白的基因表達在大鼠尿道組織中未檢測到,說明細胞外基質的合成是來源于大鼠自身組織,而不是移植的人類細胞。嚴重聯合免疫缺陷(Severe combined immunodeficiency,SCID)小鼠的體內pSMCs生物信號追蹤和免疫熒光染色結果證明pSMCs可以長

16、期存活,并融合入SCID小鼠組織且表達平滑肌細胞表型。
  結論:尿道松解術方法建立的SUI大鼠模型較為穩定,更適宜干細胞移植研究;人多能干細胞(hESC和iPSC)分化而來的平滑肌前體細胞可以恢復括約肌功能,這一發現為多能干細胞分化大量平滑肌細胞用于泌尿系統的功能恢復提供了可能性;H9-pSMC的尿道周移植能夠促進大鼠受損尿道的結構重建,其作用機制包括通過旁分泌調節ECM代謝、刺激自身括約肌修復、pSMC可能增殖并整合入再生的括

17、約肌肌層。本研究首次揭示人多能干細胞(H9hESC、iPSCs、Epi-iPSCs)來源的pSMCs能夠恢復SUI大鼠的尿道功能。iPSCs來自自體細胞,能夠減少宿主免疫排斥反應,同時也避免了hESCs應用的倫理問題。本研究使用的iPSCs有兩種誘導方式,一種是通過逆轉錄病毒,這種方式可以使病毒顆粒整合到宿主基因組中,導致基因突變,因而不能應用于臨床,另一種是通過非整合方式誘導完成的Epi-iPSCs,對人體相對無害。因此,Epi-iP

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