2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、傳統的消毒評價方法是將消毒后樣本接種到培養基中培養后觀察細菌生長情況,從而定性或定量評價消毒效果。此方法費時費力,往往影響后續工作的開展。因此,尋找快速的評價方法一直是研究人員工作的方向。本課題擬通過熒光素酶催化的生物發光反應,達到快速評價消毒效果的目的。 熒光素酶在基因工程實驗中有廣泛應用,特別是作為報告基因,對研究基因活性、基因定位、空間表達等有重要意義。熒光素酶可催化如下生化反應:Luciferase,Mg2+Lucife

2、rin+ATP+02→Oxyluciferin+AMP+pp~+COz+Light在此酶促反應中,保證反應物過量,則反應產生的熒光量就與熒光素酶活性成比例,在一定條件下即可認為與熒光素酶的量成比例。 本課題首先改構大腸桿菌,使其表達熒光素酶。通過裂解細菌,加入過量熒光素底物,利用細菌細胞中的ATP,發生上述酶促反應產生熒光。然后利用熒光光度計對反應產生的熒光進行定量,從而定量熒光素酶,進而反映細菌含量,達到評價消毒效果的目的。主

3、要結果總結如下: 1大腸桿菌的重組與鑒定 (1)用CaCl2制備大腸桿菌的感受態細胞,用含有熒光素酶基因(1uc+)的pGL3-Control質粒轉化感受態細胞,構建表達熒光素酶的重組大腸桿菌。挑選形態和大小典型的菌落,用抗生素陽性培養基培養增殖后低溫冷凍保存。 (2)從重組大腸桿菌中提取質粒,進行瓊脂糖凝膠電泳分析,證明有與pGL3一Control質粒相同大小的DNA條帶產生。進一步進行雙酶切分析,PCR擴增,

4、測序分析,結果均證明pgL3-Control質粒轉化大腸桿菌(8099)成功,所制備的重組大腸桿菌中含有pGL3-Control質粒。 (3)對保存的7株重組大腸桿菌復蘇、培養后,用熒光光度計初步測定了重糾大腸桿菌的棚對發光值(RLU)。選擇在相同菌量前提下相對發光值高的菌株作為實驗菌株進行實驗。 2生物發光法評價消毒效果的研究 (1)由于受細菌培養、熒光素酶表達量和熒光光度計靈敏度的限制,我們確定了在菌液濃度為

5、l×108cfu/ml一1×109cfu/ml時,各科實驗消毒劑及紫外線對幣紺人腸桿菌的殺火率達到99.9%f忖的殺菌劑量,并川此劑暈:進行懸液定量殺滅實驗,以使實驗后樣本可同時進行活菌培養計數和熒光測定分析。 用棚同劑黽:的消毒劑及紫外線作用于重組人腸桿菌和人腸桿菌(8099),發現重組火腸桿菌除對二氯異氰尿酸鈉的抗力增強外,對紫外線、戊二醛、過氧乙酸和碘伏的抗力與大腸桿菌(8099)相比沒有明顯變化。 (2)確定菌量

6、與RLU之問的關系。按照優化的試驗程序利用TD20/2()熒光光度計對系列稀釋度的重組大腸桿菌的RIU進行測定,川時選擇適宜稀釋度進行活菌培養計數。將二者進行統計學分析發現菌量存l×104cfu/ml一1×1010cru/m】范圍內時,菌量對數值與RLU的對數值呈直線天系(R2=0.9982,p

7、應的菌量與活菌培養計數法得到的菌量…致,說明可以用牛物發光法評價碘伏對重組大腸桿菌的殺滅效果。 測定戊二醛、過氧乙酸、二氯異氰尿酸鈉作用后樣本的RLU,其所對應的菌量高出活菌培養計數法得到的菌量卜2個數量級,但RLU大小變化與作用劑量變化一致,說明生物發光法可以部分反映殺菌效果。 測定紫外線作用后樣本的RLU,其大小變化有規律,但總體范圍與消毒作用前RLU相比無明顯下降。 采用的生物發光法評價消毒效果省卻了對人腸

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